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123儀器商城文章中心之各種色譜方法的原理

2010-12-22

                                                              123儀器商城文章中心之各種色譜方法的原理
  1、氣相色譜
  用于GC分離的組分為氣態(tài)或加熱后呈氣態(tài)，在氣相中傳質(zhì)速度快，與固定相互相作用次數(shù)多。因此，GC具有高分離交通和高選擇性，采用了靈敏的檢測裝置，故GC具有高靈敏度。
  高選擇性是指GC能分離性質(zhì)極為相近的組肆，如分離同位素和同分異的構(gòu)體等到。氫原子有3個同位素：氫（H）、氘（D）、氚（T），可組成6種氫分子，在GC上也能分離出來。有機(jī)物同分異構(gòu)體包括幾保異構(gòu)、旋光異構(gòu)等。青霉素胺是鉛中毒的排毒劑，有兩個不對稱碳原子的旋光異構(gòu)體：有右型（D-）和左型（L-），D-青霉素按有藥效作用，而L-青霉素胺有很強毒性，故要求只含有D-青霉素胺，通過毛細(xì)管氣相色譜法可以檢查出來。
  GC的高分離效能是指能分離很復(fù)雜的混合物。利用氣相毛細(xì)管色譜分離某輕質(zhì)原油中的7個碳到28個碳的烷烴。
  GC的高靈敏度是指氣相色譜可以測定含量低于10g的組分。某地天然氣泄漏，用GC可以測到植物中含10個碳到32個碳的烴類殘留。
  吸附劑的種類很多，但能作為氣固色譜固定相的吸附劑卻不多，僅有前面提到的幾種。吸附劑的性能與其制備、活化條件有很大的關(guān)系，所以分離效果不能重復(fù)，而且常在高溫下操作，陰附劑本身對分離組分有催化作用，因此氣固色譜的應(yīng)用受到某些限制。
  氣液色譜的固定相是由惰性載體和涂漬在載體上一層高沸點有機(jī)化合物薄膜組成，載體和固定液對組分離起決定性作用。載體要能牢固定液、均勻地吸收住固定液，而要分離的組分必須能溶解在固定液中。因組分之間的沸點、熔點、溶解度、汽化熱、表面張力不從心黏度等理化性質(zhì)的差異決定了這些組分在固定相中“溶解”的差異，經(jīng)過多次地溶解與析出，這些組分才得以分離。
  氣液色譜的樣品量少，僅幾微升，樣品中的組分在固定相和流動相中的分配濃度都是線性相關(guān)的，性能優(yōu)于氣固色譜，20世界50年代一經(jīng)問世，氣液色就以驚人的速度獲得廣泛的應(yīng)用。
  毛細(xì)管固色譜是在毛細(xì)管內(nèi)壁表面涂敷一層吸附劑作為固定相，稱為多孔層毛細(xì)管柱。
  毛細(xì)管氣液色譜的固定液直接涂漬在毛細(xì)管內(nèi)壁表面上稱涂層毛細(xì)管柱；在內(nèi)壁上先涂敷載體，再在載體上涂漬固定液的稱載體涂漬固定液的稱載體涂層毛細(xì)管柱。
  早先采用均勻的銅管、鋁管、玻璃管、離聚物管等做毛細(xì)管柱，一般的長度為20m左右，內(nèi)徑為250um左右。
  現(xiàn)在多采用石英彈性毛細(xì)管，不再用機(jī)械涂漬的方法涂漬固定液，而是將高沸點固定液分子的基團(tuán)與石英毛細(xì)管內(nèi)壁的硅醉或硅醚基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)鍵合起來。這樣鍵合的固定相比機(jī)械涂漬更牢靠。
  2、液相色譜
  液相色譜，就是液相吸附色譜，選用的吸附劑不能被液體流動相溶解，有足夠的比表面積，有一定的吸附能力。茨維特用碳酸鈣做固定相，石油醚做流動相，就是典型的液固色譜。通常固定相表面含有極性基團(tuán)，如硅膠，而分離的組分含有亞極性基團(tuán)，不溶于極性溶劑（水等）和非極性溶劑（醚、酯等）。用非極性流動相沖洗，要分離組分的亞極性基團(tuán)與固定相極性基團(tuán)相互作用；使得組分被吸附住，而非極性流動相又與要分離組分相互作用，沖洗這些組分離開固定相。這些分離組分存在理化性質(zhì)差異，后被分離開來。
  例如抗心絞痛藥物乙胺碘呋酮含有碘基、叔胺基等亞極性基團(tuán)，采用硅膠柱，氯仿-甲醇-氨水（497：3：0.25）為流動相做液固色譜法測定，很有效地監(jiān)護(hù)了心絞痛病人的臨床用藥。
  液液色譜現(xiàn)在就是化學(xué)鍵合相色譜，用化學(xué)的方法將固定液鍵合到載體的表面上。常用硅膠或有機(jī)高聚物為載體，以硅膠為例：硅膠鍵合相和有機(jī)高聚物鍵合相示。（A）封尾，表示用十八烷基硅烷鍵合后沒有裸露的游離硅醇，被分離組分能有效地在固定相和流動相之間連續(xù)按比例分配。（B）未封尾，表示鍵合不完全，存在裸露的硅醇，能對被分離組分有吸附作用，分離效果差。（C）聚合物涂漬，先在多孔有機(jī)層鍵合，這叫多孔有機(jī)層鍵合相。（D）表示硅烷直接鍵合在有機(jī)高聚物球表面上。
  鍵合相色譜與傳統(tǒng)的液液色譜相比，主要優(yōu)點是化學(xué)鍵合相很穩(wěn)定，在流動相中不易流失，能夠用于梯度洗脫，可以鍵合不同性能化合物，能分離范圍很廣的各種組分。
  常用的十八烷基硅烷鍵合硅膠，簡稱ODS。流動相的極性大于固定相，是典型的液相分配色譜，通常也中反相色譜。我們姑且這樣認(rèn)為，其實從化學(xué)觀點來看反相色譜有復(fù)雜的分離機(jī)理，涉及到分離的組分、流動相和鍵合相三者之間的作用。
  現(xiàn)代液相色譜分離效能高，分析速度快，檢測靈敏度高，應(yīng)用范圍廣，更適合于高沸占、大分子、極性強和熱穩(wěn)定性差的組分分離?，F(xiàn)代液相色譜已經(jīng)從經(jīng)典的液相色譜脫穎而出，與茨維特的試驗相比已不可同日而語。大家把現(xiàn)代液相色說命名為高效液相色譜（以下簡稱HPLC）。
  3、離子交換色譜
  離子交換色譜的技術(shù)、設(shè)備和采用的方法與其它類型的液要色譜基本相同，但分離的原理不同。要分離的的組分是離子型的，固定相是離子交換樹脂，帶有固定電荷的活性基團(tuán)可與組分產(chǎn)生離子交換，因相互作用親和力的差異，與固定相作用弱的組分不易保留，首先被子以水為主的緩沖液（流動相）洗脫下來。面與固定相作用強的組分被留在固定相上，要慢一步洗脫下來。結(jié)果樣品中的組分被先后有序洗脫下來，后得以彼此分離。
  離子交換色譜也已被廣泛應(yīng)用，在解決冶金、生物化學(xué)等諸多難題中發(fā)揮了重大作用。
  離子交換樹脂的交換基軒帶正電荷的稱陽離子交換樹脂，帶負(fù)電荷的稱陰離子交換樹脂。
  離子交換劑的種類很多，常用合成脂類型如下：聚苯乙烯和二乙烯基苯交聯(lián)共聚物為基質(zhì)，與芳環(huán)磺化生成強酸笥陽離子交換樹脂，或者與芳環(huán)進(jìn)行季銨鹽化生成強堿性陰離子交換樹脂。還有弱酸性、弱堿性、兩性離子交換劑等。這些離子交換劑有較大的溶脹性，不耐高壓而且多孔，不適宜裝在HPLC的術(shù)缺點，獲得較好的分離效能。幾種以硅膠為基質(zhì)的離子交換劑的健合相列。離子交換色譜的流動相以水溶液為主，一般配緩沖液以擔(dān)供平衡的反離子，使流動相保持一定的離子強度和pH值。也可加人甲醇，乙腈等有機(jī)試劑，性病組分的溶解性能和選擇性，克服色譜峰的尾現(xiàn)象。
  4、凝膠色譜
  凝膠色譜雙稱排陰色譜，也是近年發(fā)展起來的一種新型色譜，可以形象地比喻為篩子色譜。固定相為具有不同尺寸孔徑的多孔凝膠。這些孔對流動相的分子來說足夠大。它們可以自由地擴(kuò)散出入。要分離的組分一般為高聚物，雖然這些大分子也能在孔中擴(kuò)散但不那么自由。大個兒的分子擴(kuò)散速度慢且占據(jù)的孔少，小個兒的分子擴(kuò)散速度快占據(jù)的孔多，還能占據(jù)大個兒分子進(jìn)不去的小孔。分子個兒小越小可占據(jù)孔的體積越大。當(dāng)流動相通過時，在個兒分子受到的推力大，先從凝膠的大孔中跑出來，小個兒的分子比大個兒的分子在凝膠孔中停留的時間長，更小個兒的分子停留的時間更長，于是要分離組分的分子依尺寸由大到小的順序流出色譜柱。
  用于凝膠色譜的固定相分兩類，一類為有機(jī)凝膠，另一類為無機(jī)凝膠。
  有機(jī)凝膠分離效果好，但熱穩(wěn)定性、機(jī)械強度和化學(xué)惰性差，使用壽命短。有機(jī)凝膠有交聯(lián)聚苯乙烯、交聯(lián)聚乙酸乙烯酯、交聯(lián)葡聚糖等。其中交聯(lián)聚苯乙烯性能較好。
  無機(jī)凝膠分離效果差一些，但性能穩(wěn)定。與有機(jī)凝膠相比無機(jī)凝膠的熱穩(wěn)定性、機(jī)械強度、化學(xué)惰都好，使用壽命長。大的優(yōu)點是使用不同的溶劑做流動相，無機(jī)凝膠的顆粒、孔徑尺寸皆穩(wěn)定。無機(jī)凝膠有多孔硅膠、多孔玻璃球等。
  凝膠色譜主要用于高分子聚合物的分離聚合物的分離，因此對溶劑的選擇不像其它色譜那樣苛刻。組分的分離不是依賴于流動相和組分之間的相互作用，而是依賴于配制流動相的溶劑對高分子聚合物組分的溶解能力。只要純度高、腐蝕性低、溶解性能好、黏度低的溶劑都能用來配制凝膠色譜的流動相。像4氫呋喃、氯代烷烴、苯酚、取代芳烴等都可選擇作為配制凝膠色譜流動相的試劑。
  用凝膠色譜分離高聚物目的是測定分子量分布范圍和純度，測定品種范圍很廣，如一般高聚物聚苯乙烯、纖維素、橡膠、聚氨酯、滌綸、尼龍等?，F(xiàn)在凝膠色譜已向生物化學(xué)、無機(jī)化學(xué)等方面滲透，應(yīng)用范圍不斷擴(kuò)大。
  5、薄層色譜
  薄層色譜也稱平板色譜，其分離原理與液相色譜相同，故也屬于液相色譜范疇。薄層色譜的固定相為硅膠、氧化鋁、聚酰胺等極性物質(zhì)，現(xiàn)在也用硅膠為載體的鍵合相。加黏合劑或不加黏合劑用調(diào)制成糊狀，根據(jù)需要還可以加入少量乙醇有助于糊狀物均一氣泡，平鋪糊狀在玻璃板上，陰干后在烤箱內(nèi)用合適的溫度活化。在薄層板的下端用毛細(xì)管定量點樣，再將點樣過的薄層板放在帶蓋的玻璃展開槽中用展開劑（流動相）展開。必須用能溶解所有要分離組分的溶劑配樣品，點樣點不能沒入展開劑中，展開槽要密閉，使其中保持飽和的展開劑的蒸氣壓。選用的展開劑應(yīng)根據(jù)固定相和組分的性質(zhì)，可以是偏極性或非極性，也可由幾種溶劑混合組成，類似于下相色譜和反相色譜那樣的原理。
  靠固定相間毛細(xì)滲透作用，展開劑帶著點樣點中的組分慢慢上升（也有下行），經(jīng)過吸附、脫附或反復(fù)分配等到過程，樣品中的組分獲得彼此間的分離。用紫外燈、熒光燈、顯色劑顯色可以看到被分離組分的不同顏色斑點。用在同一塊薄層板上的標(biāo)準(zhǔn)對照品相對照可以獲得定性的結(jié)果。也可以刮下要定量組分的斑點（顯色劑顯色的斑點誤差大）用溶劑洗脫下來與標(biāo)準(zhǔn)品對照用比色法定量?，F(xiàn)在有了薄層色譜自動掃描儀，展開以后可直接定性定量。
  如果采用細(xì)粒度（3 ~ 5um）顆粒均勻的固定相制成薄層板叫高效薄層色譜，分離效果更好。
  薄層色譜簡單而快速，已廣泛用于各種領(lǐng)域的研究，特別對中草藥活性成分的預(yù)測，用于液相色譜方法先導(dǎo)等往往起到事半功倍的作用。
  6、紙色譜
  紙色譜是以濾紙為固定相，與薄層色譜一樣的點樣方法和展開劑，用上行法或下行法靠濾紙的毛細(xì)管表面張力使得組分移動而分離，也和薄層色譜一樣是一種液相色譜。紙色譜曾經(jīng)在植物化學(xué)的研究中被廣泛應(yīng)用。
  這里順便提一下薄層色譜和紙色譜的如何定性的。從點樣到分離組分斑點中心的距離除以從點樣到展開劑前沿的距離所得的值稱為比移值Rf(rate of flow)。在一定的色譜條件下每個組分都有一定的Rf值。如果在一塊薄層色譜板上或同一張濾紙上出現(xiàn)了一個斑點的Rf值與標(biāo)準(zhǔn)對照品的Rf值一樣，可以認(rèn)為混合試樣中含有與標(biāo)準(zhǔn)對照品一樣的組分。
  市場上曾有人用特制過士豆冒充中藥天麻，用豬膽冒充熊膽。只要用天麻的有效成分天麻素和熊膽的有效成分牛熊氧膽酸在薄層色譜或紙色譜點樣展開對照便可戳穿西洋鏡。
  7、毛細(xì)管電泳
  毛細(xì)管電泳（CE）是一種新型的分析方法，是電泳和液相色譜二者結(jié)合的技術(shù)。
  毛細(xì)管電泳的特點是：樣品用量少，納升級就可以了；不用載體可直接在緩沖液（載體電介質(zhì)中分離；溶劑用量少；可分離組分的分子量范圍寬；溶解樣品的溶劑品種多，不受限制；分離效率高。
  毛細(xì)管電泳以電泳為基礎(chǔ)。電解質(zhì)中帶電的粒子（組分）在電場的作用下以不同的速度向電荷相反的方向移動的現(xiàn)象稱為電泳。電泳使帶有不等電荷的不同組分得以分離。
  經(jīng)典電泳大缺點是兩端升高電壓會引起電介質(zhì)離子流自熱，使載板中心到兩側(cè)產(chǎn)生黏度梯度和速度梯度，導(dǎo)致區(qū)帶加寬，分離效果差。因而不能用高電壓，由此限制了電泳的使用場，全面改善分離效率。
  8、毛細(xì)管電色譜
  毛細(xì)管電色譜是HPLC與毛細(xì)管電泳的有機(jī)結(jié)合，是用電滲流或電滲結(jié)合壓力流推動相的色譜方法，是被分離組分與固定相間相互作用占主導(dǎo)地位的電泳過程。一僅克服了HPLC中壓力流造成的峰不對稱效應(yīng)，而且柱內(nèi)無壓降，獲得了近于毛細(xì)管電泳的分辨率，又具有HPLC的選擇性。
  毛細(xì)管電色譜分填充式毛細(xì)管電色譜和開管式毛細(xì)管電色譜。前者采用鍵合相填料填充到1—2mm的玻璃管中拉制而成，或者直接將填充進(jìn)毛細(xì)管柱中。后者將化學(xué)物質(zhì)直接鍵合到毛細(xì)管柱的內(nèi)壁上。
  因毛細(xì)管電色譜采用電滲流和壓力流推動流動相，所加高電壓易損傷HPLC的動力系統(tǒng)，也可能給操作者造成意外傷害。這是毛細(xì)管電色譜缺點。
  至此，歸納一下色的分離原理：混合物中的組分在流動相的推動一通過固定相，不同組分的分子以不同的平均速度移動而分離。而同一種組分的分子在固定相間也會擴(kuò)散，不會一刀切地同是離開固定相。所以，組分的分子有兩種移動：不同組分的分子移動和同組分的分子間擴(kuò)散移動。擴(kuò)散移動速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于不同組分的分子沿色譜柱方向的移動速度。只有滿足了這一條件，混合物中的組分才能彼此間分離。所有類型色譜的分離都遵循這個原理。